Стадии апоптоза

Различают три физиологические фазы апоптоза:

1. Сигнальная (активация специализированных рецепторов).

Инициация апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Например, в результате гипоксии, гипероксии, субнекротического поражения химическими или физическими агентами, перекрёстного связывания соответствующих рецепторов, нарушения сигналов клеточного цикла, удаления факторов роста и метаболизма и т.д. Несмотря на разнообразие инициирующих факторов, выделяются два основных пути передачи сигнала апоптоза: рецептор-зависимый (внешний) сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный (собственный) путь.

Рецептор-зависимый сигнальный путь

Процесс апоптоза часто (например, у млекопитающих) начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов (англ. tumor necrosis factor receptor или кратко TNFR - «рецептор фактора некроза опухолей»). Наиболее изученными рецепторами смерти, для которых описана и определена роль в апоптозе, являются CD95 (также известный как Fas или APO-1) и TNFR1 (также называемый p55 или CD120a). К дополнительным относятся CARI, DR3 (англ. death receptor 3 - «рецептор смерти 3»), DR4 и DR5.

Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти (англ. death domain или кратко DD) и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза. Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т.п.). Тримеры лигандов в результате взаимодействия тримеризуют рецепторы смерти (то есть «сшивают» 3 молекулы рецептора). Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером (или адаптерами). Для рецептора CD95 (Fas/APO-1) адаптером является FADD (от англ. Fas-associated DD-protein - «белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора»). Для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (от англ. TNFR1-associated DD-protein - «белок, взаимодействующий с доменом смерти TNFR1-рецептора»).

Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами - пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз - с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами, апоптозными шаперонами или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть (от англ. DISC - death-inducing signaling complex - «сигнальный комплекс, индуцирующий смерть»). Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8.

Рецепторы смерти, адаптеры и эффекторы взаимодействуют между собой сходными по структуре доменами: DD, DED, CARD. DD (от англ. death domain - «домен смерти») участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED (от англ. death-effector domain - «домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами?8 и?10. Домен CARD (от англ. caspase activation and recruitment domain - «домен активации и рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2.

Посредством рецепторов смерти могут быть активированы три инициирующие каспазы: ?2; ?8 и?10. Активированные инициирующие каспазы далее участвуют в активации эффекторных каспаз.

Митохондриальный сигнальный путь

Большинство форм апоптоза у позвоночных реализуется по митохондриальному пути, а не через рецепторы клеточной гибели. Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. Высвобождение апоптогенных белков, предположительно, может осуществляться двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или же путём открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.

Ключевым событием митохондриального пути апоптоза является повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий (англ. Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization, MOMP). Существенную роль в повышении MOMP играют апоптотические Bcl-2 белки - Bax и Bak. Они встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются. При этом, вероятно, нарушается целостность внешней мембраны митохондрий, по неизвестному пока механизму. При повышении MOMP из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль высвобождаются растворимые белки, участвующие в апоптозе: цитохром c - белок с молекулярной массой 15 кДа; прокаспазы?2, ?3 и?9; AIF (от англ. apoptosis inducing factor - «фактор индуцирующий апоптоз») - флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.

Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса. Поры диаметром 2,6-2,9 нм способны пропускать низкомолекулярные вещества массой до 1,5 кДа. Раскрытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; SH-реагенты; истощение клеток восстановленным глутатионом; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания Ca 2+ в цитоплазме; воздействие церамида; истощение митохондриального пула АТФ и др.

Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком APAF-1 (от англ. Apoptosis Protease Activating Factor-1 - «активирующий фактор апоптотической протеазы-1»). Предварительно, APAF-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Предполагается, что трансформированный APAF-1 приобретает способность связывать цитохром c . К тому же открывается доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка APAF-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.

2. Эффекторная (т.е. формирование из разнородных эффекторных сигналов единого пути апоптоза, и запуск каскада сложных биохимических реакций).

В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один (или несколько) общий путь апоптоза. Как правило, происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы. В процессе активации они запускают каспазный каскад: сложно переплетённые цепочки взаимодействий инициирующих и эффекторных каспаз:

Помимо каспаз существуют и другие эффекторы апоптоза. Например, флавопротеин AIF, высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий, действует по независимому от каспаз пути. Попадая в клеточное ядро, AIF вызывает конденсацию хроматина и активирует эндонуклеазы, которые участвуют в фрагментации ДНК. На основании экспериментальных данных установлено, что апоптоз, протекающий в присутствии AIF, не предотвращается ингибитором каспаз. В качестве эффекторов апоптоза также рассматриваются кальпаины - представители семейства цитозольных Ca 2+ -активируемых цистеиновых протеаз. Их роль в апоптозе пока слабо охарактеризована.

3. Деградационная (фаза экзекуции или деструкции).

Условно деградацию погибающей клетки можно разделить на три последовательных фазы: высвобождения, блеббинга и конденсации. Деградация большинства клеток начинается с высвобождения прикреплений внеклеточного матрикса и реорганизации фокальной адгезии. Внутри погибающей клетки деполимеризуются микротрубочки цитоскелета. Внутриклеточные актиновые микрофиламенты реорганизуются в связанные с мембраной периферийные (кортикальные) кольцевые пучки. В итоге клетка приобретает округлую форму. Следующая за высвобождением, стадия блеббинга, характеризуется сокращением периферийных актиновых колец. В результате сокращений клеточная мембрана образует вздутия, клетка как бы «кипит». Процесс блеббинга энергозависим и требует большого количества АТФ. Фаза блеббинга в нормальных условиях завершается примерно через час. В итоге клетка фрагментируется на маленькие апоптотические тела, либо целиком конденсируется, округляясь и уменьшаясь в размерах.

Роль белка р53

В нормальных клетках белок p53, как правило, находится в неактивной, латентной форме. Активация p53 происходит в ответ на повреждения ДНК, вызванные ультрафиолетовым или гамма-излучением, гиперэкспрессией онкогенов, вирусной инфекцией, оксидативным стрессом, гипо- и гипертермией и др. Активированный p53 координирует процесс репарации ДНК, а также регулирует транскрипцию ряда генов-активаторов апоптоза в случае необратимых повреждений ДНК или нарушений регуляции клеточного цикла. К тому же имеются указания на то, что p53 принимает участие в запуске апоптоза путём стимуляции рецепторов смерти, путём взаимодействия с промотором апоптоза - Bax, путём активации p53-зависимого модулятора апоптоза PUMA (англ. p53 upregulated modulator of apoptosis), который блокирует действие Bcl-2. Повышение уровня p53 в ответ на повреждения ДНК вызывает апоптоз, например, в клетках кожи, в тимоцитах, в клетках кишечного эпителия.

Инициация апоптоза может происходить посредством внешних или внутриклеточных факторов. Например, в результате гипоксии, гипероксии, субнекротического поражения химическими или физическими агентами, перекрёстного связывания соответствующих рецепторов, нарушения сигналов клеточного цикла, удаления факторов роста и метаболизма и т. д. Несмотря на разнообразие инициирующих факторов, выделяются два основных пути трансдукции сигнала апоптоза: рецептор-зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный путь.

Рецептор-зависимый сигнальный путь

Схема передачи сигналов апоптоза при посредстве рецепторов смерти CD95, TNFR1 и DR3

Процесс апоптоза часто начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов. Наиболее изученными рецепторами смерти, для которых описана и определена роль в апоптозе, являются CD95 и TNFR1. К дополнительным относятся CARI, DR3, DR4 и DR5.

Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене. Данная последовательность называется доменом смерти и является необходимой для трансдукции сигнала апоптоза. Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов. Тримеры лигандов в результате взаимодействия тримеризуют рецепторы смерти. Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером. Для рецептора CD95 адаптером является FADD. Для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD.

Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами — пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз — с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация каспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами, апоптозными шаперонами или сигнальными комплексами индуцирующими смерть. Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD-прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8.

Рецепторы смерти, адаптеры и эффекторы взаимодействуют между собой сходными по структуре доменами: DD, DED, CARD. DD участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами −8 и −10. Домен CARD участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2.

Посредством рецепторов смерти могут быть активированы три инициирующие каспазы: −2; −8 и −10. Активированные инициирующие каспазы далее участвуют в активации эффекторных каспаз.

Митохондриальный сигнальный путь

Митохондриальный сигнальный путь апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки. Высвобождение апоптогенных белков, предположительно, может осуществляться двумя путями: за счёт разрыва митохондриальной мембраны или же путём открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.

Модель образования апоптосомы «Цитохром c — Apaf-1 — CARD — прокаспаза-9». Активированная таким образом каспаза-9 рекрутирует прокаспазу-3, которая в свою очередь активируется до каспазы-3

Разрыв внешней мембраны митохондрий объясняется увеличением объема митохондриального матрикса. Данный процесс связывают с раскрытием пор митохондриальной мембраны, приводящим к снижению мембранного потенциала и высокоамплитудному набуханию митохондрий вследствие осмотического дисбаланса. Поры диаметром 2,6-2,9 нм способны пропускать низкомолекулярные вещества массой до 1,5 кДа. Раскрытие пор стимулируют следующие факторы: неорганический фосфат; каспазы; SH-реагенты; истощение клеток восстановленным глутатионом; образование активных форм кислорода; разобщение окислительного фосфорилирования протонофорными соединениями; увеличение содержания Ca в цитоплазме; воздействие церамида; истощение митохондриального пула АТФ и др.

В качестве альтернативного пути выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий рассматривается вариант образования белкового канала во внешней митохондриальной мембране. Так или иначе, в цитоплазму высвобождаются: цитохром c — белок с молекулярной массой 15 кДа; прокаспазы −2, −3 и −9; AIF — флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.

Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком Apaf-1. Предварительно, Apaf-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Предполагается, что трансформированный Apaf-1 приобретает способность связывать цитохром c. К тому же открывается доступ CARD-домена Apaf-1 для прокаспазы-9. В итоге происходит олигомеризация не менее 8 субъединиц трансформированного белка Apaf-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.

Другие пути индукции апоптоза

Стоит отметить, что реализация апоптоза может происходить в результате комбинированного действия двух основных сигнальных путей — рецептор-зависимого и митохондриального. Помимо этого, существует ряд менее распространённых механизмов инициации апоптоза. Например, за счёт активации прокаспазы-12, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме. Высвобождение и активация прокаспазы-12 при этом обусловлены нарушениями внутриклеточного гомеостаза ионов кальция. Активация апоптоза также может быть связана с нарушением адгезии клеток.

В качестве ещё одного фактора индукции апоптоза рассматривается атака инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые, помимо активации Fas-рецептора, способны секретировать перфорин вблизи мембраны заражённой клетки. Перфорин, полимеризуясь, образует трансмембранные каналы, через которые внутрь клетки поступают лимфотоксин-альфа и смесь сериновых протеаз. Далее гранзим B активирует каспазу-3 и запускается каспазный каскад.

Возможна инициация клеточной смерти при высвобождении лизосомальных протеаз — катепсинов. К примеру, каспаза-8 вызывает выход из лизосом активного катепсина B, который затем расщепляет регуляторный белок Bid. В результате образуется активный белок t-Bid, активирующий в свою очередь проапоптозный белок Bax.

Общая схема «классического» апоптоза млекопитающих

Эффекторная фаза

В течение эффекторной фазы различные инициирующие пути конвертируются в один общий путь апоптоза. Как правило, происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов. Основными эффекторами апоптоза являются каспазы. В процессе активации они запускают каспазный каскад: сложно переплетённые цепочки взаимодействий инициирующих и эффекторных каспаз.

Каспазный каскад

Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты. Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз, в составе которых выделяют 3 домена: регуляторный N-концевой домен, большую и малую субъединицы. Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер — полноценную каспазу с двумя каталитическими участками.

Каспазы обнаружены во большинстве живых организмов. У млекопитающих идентифицировано 13 каспаз. Часть из них в апоптозе не участвует. Остальные каспазы, которые участвуют в апоптозе, разделяют на инициаторные и эффекторные. Инициаторные каспазы активируют эффекторные каспазы, которые в свою очередь провоцируют и непосредственно участвуют в трансформации клетки. В итоге морфологические и биохимические изменения приводят к гибели клетки по типу апоптоза.

Одна из основных функций эффекторных каспаз заключается в прямом и опосредованном разрушении клеточных структур. Гидролизу подвергаются белки ядерной ламины, разрушается цитоскелет, расщепляются белки, регулирующие клеточную адгезию. Другой важной функцией эффекторных каспаз является инактивация белков, блокирующих апоптоз. В частности расщепляется ингибитор DFF, препятствующий активации апоптозной ДНКазы CAD. Разрушению подвергаются и антиапоптозные белки семейства Bcl-2. Наконец, в результате действия эффекторных каспаз происходит диссоциация регуляторных и эффекторных доменов, участвующих в репарации ДНК, мРНК-сплайсинга и ДНК-репликации.

Дополнительные эффекторы апоптоза

Помимо каспаз существуют и другие эффекторы апоптоза. Например, флавопротеин AIF, высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий, действует по независимому от каспаз пути. Попадая в клеточное ядро, AIF вызывает конденсацию хроматина и активирует эндонуклеазы, которые участвуют в фрагментации ДНК. На основании экспериментальных данных установлено, что апоптоз, протекающий в присутствии AIF, не предотвращается ингибитором каспаз. В качестве эффекторов апоптоза также рассматриваются кальпаины — представители семейства цитозольных Ca-активируемых цистеиновых протеаз. Их роль в апоптозе пока слабо охарактеризована.

Деградационная фаза

Итогом программируемой клеточной гибели вне зависимости от изначального инициирующего воздействия является деградация клетки путём фрагментации на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции.

Морфологические изменения

Условно деградацию погибающей клетки можно разделить на три последовательных фазы: высвобождения, блеббинга и конденсации. Деградация большинства клеток начинается с высвобождения прикреплений внеклеточного матрикса и реорганизации фокальной адгезии. Внутри погибающей клетки деполимеризуются микротрубочки цитоскелета. Внутриклеточные актиновые микрофиламенты реорганизуются в связанные с мембраной периферийные кольцевые пучки. В итоге клетка приобретает округлую форму. Следующая за высвобождением, стадия блеббинга, характеризуется сокращением периферийных актиновых колец. В результате сокращений клеточная мембрана образует вздутия, клетка как бы «кипит». Процесс блеббинга энергозависим и требует большого количества АТФ. Фаза блеббинга в нормальных условиях завершается примерно через час. В итоге клетка фрагментируется на маленькие апоптотические тела, либо целиком конденсируется, округляясь и уменьшаясь в размерах.

Биохимические изменения

На молекулярном уровне одним из последствий апоптоза является фрагментация ДНК с участием нуклеаз. Изначально образуются крупные фрагменты с 30 000-700 000 пар оснований, которые в дальнейшем расщепляются в межнуклеосомной области на отрезки по 180-190 пар оснований или кратные этим величинам. Фрагментация ДНК является характерным, но не обязательным признаком апоптоза, так как существуют наблюдения, в ходе которых процесс фрагментации ядра протекал без сопутствующей фрагментации ДНК.

Ещё одним существенным последствием апоптоза является экспрессия на внешней стороне плазматической мембраны специфических молекулярных маркеров, распознаваемых фагоцитирующими клетками: тромбоспондина; фосфатидилсерина и других фосфолипидов, содержащих фосфосерин.

При реализации апоптоза условно можно выделить четыре стадии.

Инициация -> Программирование -> Реализация программы -> Удаление погибшей клетки

Стадии апоптоза Стадия инициации

На этой стадии информационные сигналы рецептируются клеткой . Патогенный агент либо сам является сигналом, либо обусловливает генерацию сигнала в клетке и его проведение к внутриклеточным регулятор-ным структурам и молекулам.

Инициирующие апоптоз стимулы могут быть трансмембранными или внутриклеточными.

Трансмембранные сигналы подразделяют на отрицательные, положительные и смешанные.

- Отрицательные сигналы : отсутствие или прекращение воздействия на клетку факторов роста, цитокинов, регулирующих деление и созревание клетки, а также гормонов, контролирующих развитие клеток. В норме действие названных выше групп БАВ на мембранные рецепторы обеспечивает подавление программы гибели клеток и нормальную их жизнедеятельность. Напротив, их отсутствие или снижение эффектов «освобождает» программу апоптоза. Так, для нормальной жизнедеятельности ряда нейронов необходимо постоянное наличие нейротрофических факторов. Их устранение или снижение эффектов на нервные клетки может привести к включению программы смерти нейрона. - Положительные сигналы в итоге генерируют запуск программы апоптоза . Так, связывание ФИО (FasL) с его мембранным рецептором CD95 (Fas) активирует программу смерти клетки. - Смешанные сигналы являются комбинацией воздействий сигналов первой и второй групп. Так, апоптозу подвергаются лимфоциты, простимулированные митогеном, но не проконтактировавшие с чужеродным Аг. Погибают и те лимфоциты, на которые воздействовал Аг, но не получившие других сигналов, например митогенного или от HLA.

Среди внутриклеточных стимулов апоптоза зарегистрированы избыток Н+, свободные радикалы липидов и других веществ, повышенная температура, внутриклеточные вирусы и гормоны, реализующие свой эффект через ядерные рецепторы (например, глюкокортикоиды).

Апоптоз: стадия инициации.

Стадия программирования

Стадия программирования (контроля и интеграции процессов апоптоза) представлена на рисунке.

На этой стадии специализированные белки либо реализуют сигнал к апоптозу путём активации исполнительной программы (её эффекторами являются цистеиновые протеазы - каспазы и эндонуклеазы), либо блокируют потенциально летальный сигнал.

Выделяют два (не исключающих друг друга) варианта реализации стадий программирования : 1) путём прямой активации эффекторных каспаз и эндонуклеаз (минуя геном клетки) и 2) опосредованной через геном передачи сигнала на эффекторные каспазы и эндонуклеазы.

Прямая передача сигнала осуществляется через адапторные белки, гранзимы и цитохром С.

Адапторные белки . В качестве адапторного белка выступает, например, каспаза-8. Так реализуют своё действие цитокины Т-лимфоцитов-киллеров в отношении чужеродных клеток, ФНО и другие лиганды CD95.

Цитохром С . Выделяясь из митохондрий, цитохром С вместе с белком Apaf-1 и каспазой-9 формирует комплекс активации (апоптосому) эффекторных каспаз. Каспаза-8 и каспаза-9 активируют эффекторные каспазы (например, каспазу-3), которые участвуют в протеолизе белков.

Гранзимы . Эти протеазы выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, протеазы проникают в клетки-мишени через цитоплазматические поры, предварительно сформированные перфоринами. Гранзимы активируют аспартатспецифи-ческие цистеиновые протеазы клетки-мишени, подвергающейся апоптозу.

Прямая передача сигнала наблюдается обычно в безъядерных клетках, например в эритроцитах.

Апоптоз: стадия программирования.

Опосредованная передача сигнала подразумевает репрессию генов, кодирующих ингибиторы апоптоза, и активацию генов, кодирующих промоторы апоптоза.

Белки-ингибиторы апоптоза (например, продукты экспрессии антиапоптозных генов Bcl-2, Bcl-XL) блокируют апоптоз (например, путём уменьшения проницаемости мембран митохондрий, тем самым уменьшая вероятность выхода в цитозоль одного из пусковых факторов апоптоза - цитохрома С).

Белки-промоторы апоптоза (например, белки, синтез которых контролируется генами Bad, Box, антионкогенами Rb или /т53) активируют эффекторные кас-пазы и эндонуклеазы.

Октябрь 25, 2017 Нет комментариев

Апоптоз кардиомиоцитов начали изучать лишь в XXI веке. С научно-практической точки зрения проблема апоптоза миокарда даже в конце XX века еще не привлекала внимания исследователей. В самом деле, как можно было проявлять интерес к данной проблеме, если представляется абсурдным сам факт генетически запрограммированной гибели невосполняемых клеток жизненно важного органа. Более того, до недавнего времени существовало мнение о том, что апоптотическая смерть кардиомиоцитов в интактном миокарде вообще не возникает.

Однако использование современных методов исследования апоптоза однозначно свидетельствует о существовании этого процесса в сердце. К настоящему времени получены статистически достоверные научно-практические данные о том, что одним из ведущих механизмов, ответственных за снижение количества жизнеспособных кардиомиоцитов при определенных функциональных состояниях миокарда, является именно их программированная гибель.

Прежде всего, это относится к хронической сердечной недостаточности. Для этой формы патологии характерно перманентное прогрессирующее снижение сократительной способности левого желудочка. Одна из современных рабочих гипотез, объясняющих патогенез хронической сердечной недостаточности, предполагает участие в ее патогенезе апоптотической гибели кардиомиоцитов. Основанием для такой гипотезы явились сведения о наличии в образцах эксцентрично гипертрофированного миокарда большого количества кардиомиоцитов, содержащих деградированную ДНК.

Такие же повреждения, но в меньшем масштабе были обнаружены и в образцах концентрически гипертрофированного миокарда. Поскольку гипертрофия левого желудочка вначале развивается по концентрическому, а затем по эксцентрическому типу, обнаруженные различия в повреждении ДНК объясняли стадийностью развития сердечной недостаточности. Эксцентрическая гипертрофия - это более позднее и, следовательно, более выраженное явление, что и находило свое отражение в большей интенсивности повреждения ДНК.

На основании таких фактов можно было бы предполагать существование прямой зависимости между выраженностью сердечной недостаточности и количеством погибших кардиомиоцитов. Известно, что наиболее четко морфологические признаки апоптоза выявляют с помощью электронной микроскопии Однако исследователям вначале не удалось обнаружить полноценную картину апоптозной деградации клеток (в том числе -ядер кардиомиоцитов) при электронной микроскопии изученных образцов. Вероятно, «классическую» апоптотическую деградацию клеток наблюдали редко и/или она происходила скоротечно.

Обычно апоптозные тельца - фрагменты погибшей клетки исчезают бесследно в среднем за 90 минут. Они фагоцитируются макрофагами или соседними клетками без развития воспалительной реакции. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1-3 часа.

В последнее время апоптоз привлекает к себе внимание кардиологов как потенциальный патогенетический фактор не только прогрессирующей хронической сердечной недостаточности, но и многих других форм патологии сердечно-сосудистой системы: коронарного атеросклероза, инфаркта миокарда, крупноочагового постинфарктного кардиосклероза, кардиомиопатий и т.д. Для изучения участия апоптоза в гибели кардиомиоцитов исследуют сердца умерших от кардиоваскулярных форм патологии. Кроме того, широко изучают индуцированный апоптоз кардиомиоцитов у экспериментальных животных (крыс, кроликов, собак) в условиях моделирования таких форм патологии.

Прежде чем анализировать участие апотоза в гибели кардиомиоцитов, рассмотрим современные представления об апоптозе. В настоящее время считают, что апоптоз - это полиэтиологический процесс, т. к. индуцируется многообразными факторами и, вместе с тем, он очевидно монопатогенети-чен, т. е. в целом развивается по единому сценарию независимо от характера вызвавшей его причины. Полиэтиологичность и монопатогенетичность - это основные критерии любого типового патологического процесса. Апоптоз является эволюционно выработанным процессом, т.е. по своей сути защитно-приспособительным. Все такие процессы могут приобретать патогенный характер в определенных, конкретных условиях их возникновения и развития. Биологически активные вещества, участвующие в регуляции апоптоза, как правило, являются белками, а их синтез контролируют соответствующие гены.

К числу генов, стимулирующих апоптоз, относят гены р53, Вах, Bcl-xS. Вместе с тем, известны гены, программирующие синтез белков - ингибиторов апоптоза (Bcl-2, Ced-9, MCL-1 - induced Myeloid Leukemia Cell differentiation protein; MCL-1 - это тот самый белок, который называют «фактором выживания», так как он продлевает срок жизни клеток). Наиболее яркими и информативными белками, отражающими пролиферативные процессы в клетках и тканях, являются белки семейства Вс1-2 (их относят к классу G-белков), которые занимают центральное место в регуляции апоптоза. К настоящему времени известно, что одни белки семейства Вс1-2 являются индукторами апоптоза (Bad, Вах, J3ik, Bid, Bak), а другие - его ингибиторами (Вс1-2, Вс1~Х). Про- и антиапоптозные белки способны объединяться друге другом, формируя гомо- и гетеродимеры. Например, при объединении ингибитора апоптоза белка Вс1-2 с белком-активатором апоптоза Вах итоговый эффект, те. торможение или активация апоптоза, будет определяться тем, какой белок будет преобладать в этом комплексе.

Апоптоз играет большую роль в морфогенезе организма, являясь «инструментом» поддержания гомеостатического баланса между процессами пролиферации и гибели клеток. Это энергозависимый процесс, с помощью которого удаляют «нежелательные» и дефектные клетки организма. Причем данный процесс реализуется очень аккуратно: образующиеся в результате апоптотической гибели клеток т. н. “апоптотические тельца” немедленно фагоцитируются без развития воспаления и повреждения окружающих клеток.

Вообще программируемую клеточную смерть изучают несколько десятилетий. Термин «апоптоз» появился в 1972 г. Первыми исследователями генетических и молекулярных механизмов апоптоза были С. Бреннер, Дж. Салстон и Р. Хорвиц (ученые из Кэмбриджской лаборатории молекулярной биологии). В 2002 г. они были удостоены Нобелевской премии за исследования программируемой клеточной смерти. К настоящему времени установлено, что патогенетически значимая избыточность или недостаточность апоптоза может быть патогенетической основой многих заболеваний Интерес ученых к апоптозу связан прежде всего с возможностью воздействия на него с лечебной целью при аутоиммунных, онкологических и нсй-родегенеративных заболеваниях. За сравнительно короткий отрезок времени установлены основные механизмы реализации апоптоза и регуляторы этого процесса.

Механизмы развития апоптоза

Несмотря на разнообразие этиологических факторов, инициирующих апоптоз, в настоящее время принято выделять два основных варианта трансдукции сигнала апоптоза: рецепторно-зависимый с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный Однако эти пути развития апоптоза не являются строго параллельными, т.е альтернативными друг другу. При современных исследованиях апоптоза выявляют все больше и больше пересечений этих путей, напрааленных на достижение единой конечной цели данного процесса.

Рецепторно-опосредованный путь развития апоптоза

Рецепторно-опосредованный путь развития апоптоза, как правило, начинается с взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторы, воспринимающие сигнал апоптоза, относятся к суперсемейству TNF-рецепторов. Наиболее изученными рецепторами смерти, для которых описана и определена роль в апоптозе, являются CD95 и TNFRI.

Все рецепторы смерти представляют собой трансмембранные белки. После лиганд-рецепторного взаимодействия экстрацеллюдярные домены таких рецепторов передают сигнал интрацеллюлярным доменам рецепторов смерти, в т.ч. адаптеру для рецептора CD95 (FADD). Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с прокаспазами - пока еще не активными предшественниками - членами семейства инициаторньв каспаз. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-прокаспя за» формируются апоптосомы - агрегаты, которые обеспечивают активациию каспаз.

Митохондриальный путь развития апоптоза

Митохондриальный путь развития апоптоза инициируется повреждением митохондрий, для которого характерно главным образом увеличение проницаемости внутренней мембраны митохондрий вследствие образования в ней гигантских пор. Раскрытие таких пор могут вызывать различные причины, в том числе активные формы кислорода, включая N0, разобщение окислительного фосфорилирования, увеличение содержания Са++ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях могут вызывать также каспазы - представители рецепторно-опосредованного пути развития апоптоза. Следствием раскрытия пор являются набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и выход растворимых апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки.

В спектр таких белков входят цитохром С, митохондриальный флавопротеин AIF (Apoptoxis Inducing Factor) - индуктор апоптоза, прокаспазы 2,3 и 9.

Высвобождаемый из митохондрий цитохром С совместно с цитоплазматическим фактором APAF-1 (Apoptosis Protease Activating Factor-1 - активирующий фактор апоптотической протеазы-1) образует конструкцию, получившую название апоптосома, которая обеспечивает активацию каспазы 9. Предварительно APAF-1 претерпевает энергозатратные конформационные изменения, благодаря которым приобретает способность связывать цитохром С. Образовавшаяся аполтосома активирует прокаспазу 3 с образованием эффекторной каспазы 3.

Высвобождаемый из митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.

Итогом программируемой клеточной гибели вне зависимости от изначального инициирующего воздействия являются фрагментация ДНК с участием нуклеаз, а также распад клетки на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. На внешней стороне мембраны экспрессируются специфические молекулярные маркеры, распознаваемые фагоцитирующими клетками. Таким образом, реализация апоптоза, как правило, обеспечивается интегрированным взаимодействием двух основных сигнальных путей - рецепторзависимого и митохондриального.

На сегодняшний день разработано несколько десятков методов выявления и изучения апоптотических клеток in vivo и in vitro. Эти методы базируются на качественной или количественной оценке событий, вызванных изменениями в наружной мембране клеток, избирательной фрагментацией ядерной ДНК, изменениями структуры внутриклеточных компонентов или их перераспределением. Для определения апоптотических клеток, кроме световой и флуоресцентной микроскопии, используют лазерную сканирующую и проточную цитометрию, однофотонную эмиссионную компьютерную томографию, магнитно-резонансную томографию, магнитно-резонансную спектроскопию, позитронно-эмиссионную томографию и т.д.

Результаты подсчета с помощью электронной микроскопии количества апоптотически измененных клеток на полутонком срезе исследуемой ткани выражают в виде так называемого индекса апоптоза (АИ), который на сегодняшний день является «золотым стандартом» оценки апоптоза:

АИ = Количество апоптотических клеток/

Общее количество клеток х 100.

Использование различных методик изучения апоптоза позволило закономерно обнаруживать улътраструктурные дегенеративные изменения кар-дном ионитов у больных кардиомиопатиями, гипертрофией сердца и хронической сердечной недостаточностью. Многочисленными исследованиями установлено повышение интенсивности апоптотических процессов в миокарде левого желудочка при его хронической перегрузке в условиях развития артериальной гипертензии. Увеличение индекса апоптоза обнаружено и в миокарде правого желудочка при повышении гемодинамической нагрузки (преднагрузка объемом) на сердце.

В экспериментах с моделированием артериальной гипертензии выявлена выраженная положительная корреляционная связь между степенью развития гипертрофии миокарда и интенсивностью апоптоза кардиомиоцитов. Предполагают, что фактором, активирующим программированную гибель кардиомиоцитов при гемодинамической перегрузке (постнагрузка давлением или преднагрузка объемом) сердца, являются повышение конечного диастолического объема в желудочках, детерминирующее увеличение степени растяжения кардиомиоцитов. При растяжении стенки желудочков активизируется поступление в кардиомиоциты ионов Са++, стимулирующих каспазный механизм апоптоза.

Активация апоптоза кардиомиоцитов при артериальной гипертензии может быть также обусловлена действием ангиотензина И, образование которого неразрывно связано со стимуляцией локальной кардиальной РААС. Ангиотензин II, который был обнаружен в тканях предсердий человека, реализует свое действие через рецепторы II типа. Этот тип рецепторов находится в экспрессированном состоянии в эмбриональном периоде, но отсутствует в постнатальном. Однако при дисфункции миокарда происходит реэкспрессия этого типа рецепторов к ангиотензину II. Кардиальный ангиотензин II, кроме указанных выше эффектов, способен индуцировать апоптотическую гибель кардиомиоцитов. Установлено, что проапоптогенный эффект ангиотензина-Н может реализоваться за счет его способности стимулировать продукцию Вах-протеина (Вс1-2 ассоциированный Х-протеин), а также образование активных форм кислорода.

В последнее время появились работы, в которых были предприняты попытки определить механизмы, опосредующие взаимосвязь между степенью развития гипертрофии миокарда и интенсивностью апоптоза при экспериментальной артериальной гипертензии.

Определенную роль в стимуляции апоптоза кардиомиоцитов играют SMAD-протеины (SMAD - Similar to Mothers Against Dectapentaplejpc). Это внутриклеточные белки, которые опосредуют сигнализацию от рецептора TGF-pl. Предполагают, что SMAD-протеины являются факторами перехода от компенсаторного гипертрофического роста к сердечной недостаточности.

Высказывается предположение о том, что апоптотическая гибель гипертрофированных кардиомиоцитов может реализовываться за счет некаспат ных механизмов, опосредованных, в частности, апоптозиндуцируюпшм фактором AIF (Apoptosis Inducing Factor); это митохондриальный флавопротеик локализованный между внутренней и наружной мембранами митохондрий При деструкции митохондрий, вызванной активными формами кислорода и ионами кальция, AIF высвобождается из митохондрий, а затем трансто-пируется в ядро. Механизм апоптогенного эффекта AIF состоит в активагш эндонуклеазы, расщепляющей ДНК, что манифестируется конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК.

В ряде публикаций обсуждается возможность участия аннексинового механизма в интенсификации апоптоза кардиомиоцитов при гипертоническом поражении сердца. Аннексии А5 (АпхА5) представляет собой Са~+ связывающий протеин, который активируется при воздействии различных апоптотаческих стимулов на кардиомиоциты и другие клетки миокарда. Предполагают, что внутриклеточный аннексии А5 способствует реализации апоптотических процессов за счет влияния на обмен кальция и состояние митохондрий.

В качестве общего фактора, индуцирующего параллельное развитие гипертрофии миокарда и активизацию апоптотических процессов по митохондриальному пути при гемодинамической перегрузке левого желудочка, может также быть оксидативный стресс.

Представляются весьма интересными результаты исследования, в котором различные маркеры апоптоза, в том числе Fas,белки семейста Всl-2, каспазы, определяли в миокарде как при его физиологической (компенсаторной), так и при патологической гипертрофии. Установлено, что повышенную чувствительность к апоптогенным стимулам проявляют только гипертрофированные кардиомиоциты. При этом оказалось, что при патологической гипертрофии проапоптозные изменения выражены в большей степени, чем при физиологической.

Несмотря на то, что в большинстве работ имеются указания на индукцию митохондриального пути апоптогенной сигнальной трансдукции и ее связь с формированием гипертрофии миокарда, в некоторых экспериментах изучали и рецепторно-опосредованный механизм. В частности, in vitro было установлено, что при искусственной стимуляции Fas-рецепторов мышиных кардиомиоцитов развивалась их выраженная гипертрофия, связанная с инактивацией гликогенсинтазы киназы 3-р (GSK3-0).

Интенсивность апоптоза кардиомиоцитов связывают также с адренергической регуляцией. Так, фармакологические исследования in vitro подтвердили, что при стимуляции Pj-адренорецепторов (активация этих рецепторов приводит к повышению минутного объема кровообращения за счет увеличения ударного объема и тахикардии) индуцируется апоптоз кардиомиоцитов, предположительно связанный с цАМФ и кальциевым механизмом. Активация р2-адренорецепторов, напротив, вызывает антиапоптозный эффект. Считают, что p-адренергическая индукция апоптоза реализуется по митохондриальному сигнальному пути, поскольку при снижении проницаемости мембраны митохондрий или активности каспаз уменьшается интенсивность апопшгических процессов, вызванных стимуляцией p-адренорецепторов.

Провоспалительные цитокины TNF-a, IL-ip, IL-6 совместно с активными формами кислорода способны нарушать внутриклеточный обмен Са++. При этом считают, что провоспалительные цитокины в большей степени ответственны за индукцию апоптоза посредством их соединения с мембранными рецепторами (рецепторно-опосредованный путь), тогда как кальциевая перегрузка преимущественно вызывает некротические изменения за счет повреждения митохондрий (митохондриальный путь). Повышенный уровень TNF-a коррелирует с тяжестью проявлений хронической сердечной недостаточности. На сегодняшний день установлено, что противовоспалительные цитокины IL-10, TGF-p ингибируют апоптогенную активность TNF-a в кардиомиоцитах. Аналогичное свойство проявляет фактор SOCS-1 (Suppressor of Cytokine Signaling-1 - супрессор цитокинового сигнала -1). Механизм действия последнего реализуется через модуляцию МАРК (Mitogen-Activate Protein Kinase - митогенакгивируемые протеинкиназы).

В последнее время активно изучают механизмы программированной клеточной гибели кардиомиоцитов и других клеточных элементов миокарда при различных кардиодистрофических процессах, в первую очередь при кардиомиопатиях. Относительно роли апоптоза в динамике морфологических изменений миокарда при дилатационной кардиомиопатии мнения различных авторов расходятся. В более ранних работах отмечали, что нет четких доказательств участия апоптотических механизмов в развитии данной формы патологии. Однако использование современных тонких методов детекции маркеров апоптоза позволило другим исследователям установить обратное.

Апоптоз кардиомиоцитов при гипертрофической и рестриктивной кардиомиопатиях на сегодняшний день остается малоизученным.

Усиление апоптоза кардиомиоцитов наблюдают при многих распространенных формах патологии сердца. Особое внимание при этой уделяют изучению процесса апоптоза в патогенезе хронической сердечной недостаточности. Пока не имеется достаточно убедительных доказательств влияния апоптоза на сократительную активность миокарда. Кроме того, на сегодняшний день недостаточно изучены незавершенные и обратимые формы апоптоза, о существовании которых свидетельствует целый ряд современных научных исследований.

Вместе с тем, к настоящему времени уже появились фармакологические средства, способные эффективно ингибировать апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный различными стимулами. Эти средства преимущественно применяют в экспериментальных условиях. Накоплен также определенный опыт их использования в клинической практике. Исходя из современных представлений о механизмах развития апоптоза, основу патогенетической терапии повреждений миокарда, детерминированных активацией апоптоза, составляет блокада (ингибирование) данного процесса на разных стадиях его развития (индукция, трансдукция, транслокация, реализация апоптогенной генетической программы).

Антиапоптогенный эффект может быть также достигнут посредством воздействия на уровне рецепторов. В экспериментах, например, было установлено, что IL-33 предупреждает апоптоз кардиомиоцитов и улучшает функцию сердца у мышей с инфарктом миокарда. IL-33 взаимодействует с мембранным рецептором ST2. ST2 (Growth Slimulation expressed gene t стимулирующий фактор роста, экспрессируемый геном 2) - это член семейства рецепторов IL-1, относится к новейшим маркерам, используемым для прогнозирования риска развития неблагоприятных исходов и летальности пациентов с подтвержденным диагнозом сердечной недостаточности. ST2 экспрессируется в сердце в ответ на патологические изменения, вызванные хроническими заболеваниями сердца и/или его острыми повреждениями, и отражает процессы ремоделирования желудочков сердца.

В клинической практике примером препарата, обладающего свойством ингибировать апопотоз на уровне рецепторов, может быть карведилол. Применение данного официального препарата существенно снижает уровень смертности больных сердечной недостаточностью. В спектре эффектов карведилола выделяют его антиапоптотическое действие, которое основано на подавлении экспрессии миокардиальных Fas-рецепторов и ингибировании SAPK (Stress-Activated Protein Kinase) -протеинкиназы (этот фермент активируется в условиях развития стресса).

Благоприятный антиапоптогенный эффект может быть достигнут применением ингибиторов каспаз. В экспериментальных условиях, например, доказано, что использование хлорометилкетона, способного подавлять активацию каскада каспаз, сокращает зону инфаркта у подопытных кроликов примерно на 30%.

Другой пример – результаты исследования влияния на апоптоз кардиомиоцитов мицеллярной формы изосорбида динитрата - экзогенного донора оксида азота. В опытах на крысах с моделированной коронарной недостаточностью, подвергнутых стрессорному воздействию, введение этого препарата приводило к снижению количества «апоптотических» клеток, уменьшению зоны ишемии по сравнению со стрессовой группой животных. Авторы данного исследования предполагают, что механизмы подавления апоптоза связаны со сложным взаимодействием между белками теплового шока, антиапоптотическими белками Вс1-2, различными каспазами и оксидом азота. Эти исследователи считают, что мицеллярная форма изосорбида динитрата может быть рекомендована для применения в клинической практике с целью ингибирования апоптоза кардиомиоцитов в условиях развития коронарной болезни и сердечной недостаточности.

Совсем недавно было установлено, что некоторые гормональные препараты обладают цитопропгекторным эффектом, основанным на антиапоптозной активности в отношении кардиомиоцитов. В частности, обнаружена способность прогестерона уменьшать апоптотическую гибель кардиомиоцитов за счет активации экспрессии генов, кодирующих синтез Bcl-xL. Анти-апоптогенную активность проявляют кортикостероиды (гидрокортизон, кортизон, альдостерон).

Другим возможным вариантом фармакологического подавления апоптоза кардиомиоцитов является блокада экспрессии «популярного» гена р53.

В заключение отметим, что апоптоз - это эволюционно-выработанный типовой патологический процесс, который при ремоделировании миокарда может иметь как защитно-приспособительное, так и патогенное значение в зависимости от конкретных условий его развития. Активация апоптотической гибели кардиомиоцитов происходит при многих формах нарушения насосной функции сердца, нередко при этом играя роль основного патогенетического фактора, например, при хронической сердечной недостаточности.

К настоящему времени на молекулярном уровне расшифрован целый ряд механизмов апоптотической гибели кардиомиоцитов.

Определение апоптоза. Апоптоз – феномен наследственно запрограммированной смерти клеток. Каждая клетка при своем рождении как бы запрограммирована на самоуничтожение. Условие ее жизни – блокирование этой суицидальной программы.

Апоптоз реализуется для клеток:

Старых, отживших свой срок;

Клеток с нарушениями дифференцировки;

Клеток с нарушениями генетического аппарата;

Клеток, пораженных вирусами.

Морфологические признаки апоптоза.

Сморщивание клетки;

Конденсация и фрагментация ядра;

Разрушение цитоскелета;

Буллезное выпячивание клеточной мембраны.

Особенность апоптоза – апоптоз не вызывает воспаления в окружающих тканях.Причина - сохранность мембраны и → изоляция повреждающих факторов цитоплазмы до полного завершения процесса (О 2 - , Н 2 О 2 , лизосомальные ферменты). Эта особенность – важная позитивная черта апоптоза, в отличие от некроза. При некрозе мембрана повреждается (или разрывается) сразу же. Поэтому при некрозе содержимое цитоплазмы высвобождается (О 2 - , Н 2 О 2 , лизосомальные ферменты). Возникает повреждение соседних клеток и воспалительный процесс. Важная черта апоптоза - удаление умирающих клеток происходит без развития воспаления.

Процесс апоптоза - может быть разделен на 2 (две) фазы:

1. Формирование и проведение апоптических сигналов – фаза принятия решения.

2. Демонтаж клеточных структур – эффекторная фаза.

1-я фаза – принятия решения (=формирование и принятие апоптических сигналов). Это фаза принятия стимулов для апоптоза. В зависимости от характера стимулов, может быть 2 (два) типа сигнальных путей:

1) повреждение ДНК в результате радиации, действия токсических агентов, глюкокортикоидов и т.д.

2) активация рецепторов «региона клеточной смерти» . Рецепторы «региона клеточной смерти» - это группа рецепторов на мембранах любых клеток, которые воспринимают проапоптические стимулы. Если количество и активность таких рецепторов увеличивается, то увеличивается количество апоптически гибнущих клеток. К рецепторам «региона клеточной смерти» относятся: а) TNF-R (связывается с фактором некроза опухолей и активирует апоптоз); б) Fas-R (к); в) CD45-R (связывается с антителами и активирует апоптоз).

В зависимости от типа сигнала, существует 2 (два) основных способа апоптоза: а) в результате повреждения ДНК;

б) в результате самостоятельной активации рецепторов «региона клеточной смерти» без повреждения ДНК.

2-я фаза – эффекторная (=демонтаж клеточных структур. Основные фигуранты эффекторной фазы:

Цистеиновые протеазы (каспазы);

Эндонуклеазы;

Сериновые и лизосомальные протеазы;

Протеазы, активированные Ca ++ (кальпейн)

Но! Среди них основные эффекторы демонтажа клеточных структур – каспазы.

Классификация каспаз - 3 (три) группы:

Эффекторные каспазы - каспазы 3, 6, 7.

Индукторы активации эффекторных каспаз – каспазы 2, 8, 9, 10. = активаторы цитокинов – каспазы 1, 4, 5, 13.

Эффекторные каспазы – каспазы 3, 6, 7. Это непосредственные исполнители апоптоза. Эти каспазы находятся в клетке в неактивном состоянии. Активированные эффекторные каспазы начинают цепь протеолитических событий, целью которых является «демонтаж» клетки. Их активируют индукторы активации эффекторных каспаз.

Индукторы активации эффекторных каспаз – каспазы 2, 8, 9, 10. Основные индукторы – каспазы 8 и 9 . Они активируют эффекторные каспазы. Механизм – расщепление аспарагиновых оснований с последующей димеризацией активных субъединиц. Эти каспазы при обычном состоянии в клетках неактивны, существуют в форме прокаспаз.

Активация тех или иных индукторов зависит от типа сигнального пути:

1. При повреждении ДНК задействован сигнальный путь № 1, активируется каспаза № 9.

2. При активации рецепторов клеточной смерти задействован сигнальный путь № 2, активируется каспаза № 8.

Сигнальный путь № 1 (связан с повреждением ДНК)

Повреждение ДНК

Активация гена р53 и продукция соответствующего белка

Активация проапоптических генов семейства BCL-2 (BAX и BID)

Образование белков этих генов

Активация каспазы 9

Активация каспазы 3

Сигнальный путь № 2

(связан с активацией «региона клеточной смерти»)

Лиганд + рецепторы «региона клеточной смерти»

Активация каспазы № 8

Независимая активация каспазы № 3

Активация других каспаз и протеаз

Регуляция апоптоза. Исследования последних лет привели к созданию модели апоптоза. По этой модели каждая клетка при своем рождении запрограммирована на самоуничтожение. Следовательно, условием ее жизни является блокирование этой суицидальной программы. Основная задача регуляции апоптоза – держать эффекторные каспазы в неактивном состоянии, но быстро переводить их в активную форму в ответ на минимальное действие соответствующих индукторов.

Отсюда, понятие ингибиторов и активаторов апоптоза.

Ингибиторы апоптоза (=антиапоптические факторы). К наиболее серьезным ингибиторам апоптоза относятся ростовые факторы. Другие: нейтральные аминокислоты, цинк, эстрогены, андрогены, некоторые белки.

Пример: Белки семейства IAP – подавляют активность каспаз 3 и 9. Запомнить: один из этих белков (Survin) обнаружен в опухолевых клетках. С ним связывают резистентность опухолевых клеток к химиотерапии

Активаторы апоптоза (=проапоптические факторы). Это проапоптические гены и их продукция: а) гены семейства BCL-2 (BAX и BID); б) гены Rb и P53 (запускают апоптоз, если клетка задержана механизмом checkpoint.

Резюме. Патогенез многих заболеваний, в том числе и опухолевых, связан со снижением способности клеток подвергаться апоптозу. Отсюда накопление поврежденных клеток и формирование опухоли.

ПАТОФИЗИОЛОГИЯ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ

Основное отличие деления здоровой и опухолевой клетки:

Деление здоровой клетки регулируется паракринным и эндокринным способом. Клетка подчиняется этим сигналам и делится только в том случае, если организм нуждается в образовании новых клеток данного вида.

Деление опухолевой клетки регулируется аутокринным способом. Опухолевая клетка сама образует митогенные стимуляторы и сама же делится под их влиянием. Она не отвечает на паракринные и эндокринные стимулы.

Существует 2(два) механизма опухолевой трансформации клеток:

1. Активация онкогенов.

2. Инактивация генов-супрессоров.

АКТИВАЦИЯ ОНКОГЕНОВ

Прежде всего 2 (два) главных понятия: = протоонкогены;

Онкогены.

Протоонкогены – это нормальные, неповрежденные гены, которые контролируют деление здоровой клетки.

К протоонкогенам относятся гены, контролирующие образование и работу:

1. Ростовых факторов.

2. Мембранных рецепторов к ростовым факторам, например тирозинкиназных рецепторов.

3. Ras-белков.

4. MAP-киназ, участниц МАР-киназного каскада.

5. Транскрипционных факторов AP-1.

Онкогены – поврежденные протоонкогены. Процесс повреждения протоонкогена и трансформация его в онкоген называется активация онкогена.

Механизмы активации онкогена.

1. Включение (вставка) промотора. Промотор – это участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза протоонкогена. Необходимое условие – промотор должен находится в непосредственной близости с протоонкогеном. Отсюда варианты: а) промотор - ДНК-копия онкорнавирусов; б) «прыгающие гены» - участки ДНК, способные перемещаться и встраиваться в разные участки генома клетки.

2. Амплификация – увеличение числа протоонкогенов или появление копий протоонкогенов. Протоонкогены в норме обладают небольшой активностью. При увеличении числа или появлении копий их общая активность значительно возрастает и это может привести к опухолевой трансформации клетки.

3. Транслокация протоонкогенов. Это перемещение протоонкогена в локус с функционирующим промотором.

4. Мутации протоонкогенов.

Продукция онкогенов. Онкогены образуют свои белки. Эти белки называются «онкобелки».

Синтез онкобелков называется «экспрессия активных клеточных онкогенов».

Онкобелки – в основе своей есть аналоги белков протоонкогенов: ростовых факторов, Ras-белков, МАР-киназ, транскрипционных факторов. Но есть количественные и качественные отличия онкогенов от белков протоонкогенов.

Отличия онкобелков от нормальной продукции протоонкогенов:

1. Увеличение синтеза онкобелков по сравнению с синтезом белков протоонкогенов.

2. Онкобелки имеют структурные отличия от белков протоонкогенов.

Механизм действия онкобелков.

1. Онкобелки соединяются с рецепторами для факторов роста и образуют комплексы, постоянно генерирующие сигналы к делению клетки.

2. Онкобелки повышают чувствительность рецепторов к факторам роста или понижают чувствительность к ингибиторам роста.

3. Онкобелки могут сами действовать как факторы роста.

ИНАКТИВАЦИЯ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ

Гены-супрессоры: Rb и р53.

Их продукция – соответствующие белки.

Инактивация генов-супрессоров (наследственное или приобретенное) ведет к пропуску в митоз клеток с поврежденной ДНК, размножению и накоплению этих клеток. Это – возможная причина формирования опухоли.

ОПУХОЛЕВЫЙ РОСТ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ, ПРИЧИНЫ УВЕЛИЧЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Опухоль – патологическое разрастание, отличающееся от других патологических разрастаний наследственно закрепленной способностью к неограниченному неконтролируемому росту.

Другие патологические разрастания – гиперплазия, гипертрофия, регенерация после повреждения.

Причины увеличения количества злокачественных заболеваний среди населения:

1. Увеличение продолжительности жизни.

2. Улучшение качества диагностики → увеличение выявляемости онкологических заболеваний.

3. Ухудшение экологической обстановки, увеличение содержания канцерогенных факторов в окружающей среде.

ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫЕ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ ОПУХОЛИ

Единой классификации опухолей до сих пор не создано. Причина:

1. Большое разнообразие признаков, характерных для различных опухолей.

2. Недостаточность знания их этиологии и патогенеза.

В основе современных классификаций - главные морфологические и клинические признаки опухолей.

На основе клинической характеристики все опухоли делят на доброкачественные и злокачественные.

Доброкачественные опухоли:

1. Клетки опухоли морфологически идентичны или похожи на нормальные клетки-предшественники.

2. Степень дифференцировки опухолевых клеток – достаточно высокая.

3. Скорость роста – медленная, в течение многих лет.

4. Характер роста – экспансивный, т.е. во время роста опухоли соседние ткани раздвигаются, иногда сдавливаются, но обычно не повреждаются.

5. Отграниченность от окружающих тканей – четкая.

6. Способность к метастазированию – отсутствует.

7. Отсутствие выраженного неблагоприятного воздействия на организм. Исключение: опухоли, расположенные вблизи жизненно важных центров. Пример: опухоль головного мозга, сдавливающая нервные центры.

Злокачественные опухоли.

1. Клетки опухоли морфологически отличаются от нормальной клетки-предшественницы (часто до неузнаваемости).

2. Степень дифференцировки опухолевых клеток – низкая.

3. Скорость роста – быстрая.

4. Характер роста – инвазивный, т.е. опухоль прорастает в соседние структуры. Способствующие факторы:

Приобретение опухолевыми клетками способности отшнуровываться от опухолевого узла и активно перемещаться;

Способность опухолевых клеток продуцировать «канцероагрессины». Это белки, которые проникают в окружающие нормальные ткани и стимулируют хемотаксис для опухолевых клеток.

Уменьшение сил клеточной адгезии. Это облегчает отшнуровку опухолевых клеток от первичного узла и их последующее движение.

Уменьшение контактного торможения.

5. Отграниченность от окружающих тканей – нет.

6. Способность к метастазированию – выражена.

7. Воздействие на организм – неблагоприятное, генерализованное.